L’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array – Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH) è una tecnica sviluppata per identificare identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y), o anche variazioni (variazioni del numero di copie – CNV) del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come duplicazioni/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA), o delezioni (perdite di porzioni di genoma). Queste anomalie del DNA possono essere la causa di diverse patologie quali, ad esempio, sindromi malformative, ritardo mentale, autismo, epilessia e tumori.
Il principio su cui si basa la tecnica dell’Array CGH è la comparazione quantitativa del DNA in esame o DNA test (estratto dalle cellule fetali, in caso di diagnosi prenatale, o dal prelievo ematico del paziente, in caso di diagnosi post-natale) e del DNA genomico di riferimento proveniente da un soggetto sano (reference DNA).
Durante il processo analitico questi DNA sono marcati in maniera differenziale con molecole fluorescenti (generalmente si utilizza un fluorocromo rosso il DNA test ed un fluorocromo verde per il reference DNA) e, successivamente, vengono mescolati in parti uguali e fatti incubare (Ibridazione) su un microarray, costituito da un supporto di vetro la cui superficie è coperta di frammenti di DNA, noti come sonde o cloni. Ognuno di questi cloni rappresenta una specifica regione del genoma umano, fino a ricomprendere l’intero assetto cromosomico umano. Tanto più è elevato il numero di cloni maggiore è l’efficacia dell’array nell’identificazione delle variazioni del numero di copie. corrispondenti a piccole porzione di ciascun cromosoma. Il potere risolutivo della piattaforma utilizzata può variare in funzione della densità e della tipologia delle sonde utilizzate; attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array tra 1 Mb e 100 kb.
Al termine della suddetta incubazione, sia il DNA in esame che quello di controllo si legheranno ai cloni presenti sull’array. Il risultato sarà l’emissione di due distinti segnali fluorescenti le cui intensità saranno misurante a seguito di lettura degli arrays mediante un apposito strumento (scanner). Sull’immagine ottenuta verrà poi effettuata l’analisi comparativa tra le intensità di fluorescenza emesse dai due DNA e la relativa elaborazione dei dati mediante un apposito software, al fine evidenziare eventuali variazioni del numero di copie del DNA test.
In caso di assetto cromosomico normale, il rapporto tra le due emissioni è bilanciato (1:1). Qualora vi siano nel DNA in esame (fetale) delle delezioni (assenza di un cromosoma o parte di esso), il rapporto tra quest’ultimo ed il DNA di controllo sarà di 1:2 (monosomia completa o parziale). Nel caso di duplicazioni (presenza di un cromosoma soprannumerario o parte di esso) il rapporto tra il DNA embrionale e quello di controllo sarà di 2:1 (trisomia completa o parziale).
Quali sono i vantaggi della tecnica Array-CGH?
La citogenetica tradizionale, pur utilissima nell’individuare un gran numero di anomalie cromosomiche, numeriche e strutturali, è necessariamente limitata nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione del microscopio. Soprattutto nelle malattie genetiche caratterizzate da vari dismorfismi e/o ritardi mentali, l’analisi del cariotipo con tecnica citogenetica tradizionale, a causa del suo basso potere di risoluzione, potrebbe risultare normale malgrado il un fenotipo chiaramente patologico.
Il maggiore progresso degli ultimi anni, nel campo della citogenetica, e’ rappresentato dallo sviluppo della tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridation), una metodologia citochimica che consente di individuare specifiche sequenze di DNA a livello cromosomico. Il principio su cui si basa è l’appaiamento tra una sonda marcata (frammento di DNA specifico per la regione d’interesse contenente nucleotidi modificati) ed il DNA cromosomico del soggetto in studio, fissato su un vetrino. Tale tecnica permette di identificare marcatori cromosomici, di visualizzare traslocazioni bilanciate e non bilanciate, duplicazioni e riarrangiamenti cromosomici.
Un esempio di applicazioni della metodica FISH nella diagnostica clinica è rappresentato dallo studio della sindrome di DiGeorge, una malattia congenita causata da una serie di anomalie a carico del cromosoma 22. Nello studio di tale patologia, la maggior parte gli individui affetti da sindrome di DiGeorge presentava un assetto cromosomico normale all’analisi citogenetica convenzionale. Quando sequenze di DNA relative a regioni del cromosoma 22 coinvolte in tale sindrome sono state clonate, marcate ed utilizzate per l’indagine FISH, in più di 3⁄4 degli individui affetti sono state evidenziate delezioni cromosomiche: la maggior parte di queste, risultate troppo piccole per essere visibili nelle preparazioni citogenetiche standard, sono state facilmente evidenziabili dall’assenza di un segnale FISH su un cromosoma omologo.
La FISH, nonostante sia di grande applicazione nella diagnosi clinica odierna, è necessariamente limitata dal fatto di essere una tecnica di “indagine mirata”: la sua applicazione consente solo di poter individuare mutazioni specifiche a livello di precisi loci cromosomici.
Con l’impiego della tecnica Array-CGH si è grado di valutare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche a livello dell’intero genoma in un unico esperimento, senza sapere in anticipo cosa cercare.
Rispetto ad altre metodiche di indagine, come l’esame tradizionale del cariotipo, l’analisi del genoma basata su array ha una risoluzione molto più elevata (~100volte). Ciò consente di evidenziare anomalie del DNA che normalmente non potrebbero essere rilevate, incrementando notevolmente le possibilità di raggiungere una diagnosi certa. Inoltre, l’array-CGH permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra variazioni del numero di copie e patologia.
Questo tecnica viene prevalentemente utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile. Tuttavia, l’Array-CGH trova impiego anche come tecnica di routine nella diagnosi prenatale, ed è particolarmente indicata per pazienti con feto i cui segni ecografici sono riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo è però risultato normale. I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10%).
La tecnologia microarray rappresenta oggi uno strumento fondamentale per il raggiungimento di una corretta diagnosi di laboratorio per diverse malattie genetiche.
Quali sono le indicazioni all’uso della tecnica Array-CGH?
L’Array-CGH viene prevalentemente utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile.
Questo tecnica anche trova impiego anche come tecnica di routine nella diagnosi prenatale, ed è particolarmente indicata per pazienti con feto i cui segni ecografici sono riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo è però risultato normale. In questi casi, l’array-CGH rappresenta una procedura ideale di approfondimento diagnostico di secondo livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale, al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l’indagine del cariotipo fetale. L’integrazione dell’analisi citogenetica convenzionale con l’array-CGH incrementa notevolmente le possibilità di determinare le cause della patologia riscontrata nel feto ed eventualmente permette di definire più accuratamente il rischio di ricorrenza.
Le principali indicazioni per l’impiego dell’array-CGH quale tecnica di approfondimento diagnostico in diagnosi prenatale sono le seguenti:
- Difetti dello sviluppo fetale evidenziati tramite ecografia;
- Anomalie cromosomiche (riarrangiamenti sbilanciati, riarrangiamenti apparentemente bilanciati de novo e cromosomi marcatori) individuate attraverso l’analisi citogenetica prenatale;
- Aborti spontanei e terapeutici.
L’array specificatamente utilizzato in diagnosi prenatale è costituito da cloni che coprono le regioni critiche interessate da microdelezioni associate a un gran numero di sindromi che non possono essere diagnosticate con un cariotipo tradizionale, come la Sindrome di DiGeorge (VCFS), la Sindrome di Williams, la Sindrome di Praeder-Willi/Angelman. Oltre ai cloni per sindromi da microdelezione, nel chip sono compresi anche cloni per le regioni subtelomeriche.
Particolare importanza riveste questa applicazione pre-natale nell’esame del liquido amniotico o dei villi coriali in quanto con una sola determinazione è possibile rilevare circa 100 patologie non diagnosticabili diversamente, che provocano ritardo mentale e patologie correlate nel bambino.
I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10%).
È importante sottolineare la necessità che questa tecnica sia utilizzata da laboratori dotati di provata competenza di genetica molecolare, nonché di esperienza nella interpretazione dei risultati prodotti dalla array-CGH.
La identificazione di uno sbilanciamento genomico richiede la conferma attraverso altre tecniche quali la ibridazione in situ o la PCR quantitativa e la estensione delle indagini ai genitori.
Le piattaforme Array-CGH?
Attualmente sono disponibili diverse tipologie di piattaforme array-CGH. Queste possono essere suddivise in due categorie principali, a seconda del tipo di sonde presenti sull’array, che sono “BAC-arrays” e “oligo-arrays”.
I BAC-arrays, attualmente considerati arrays di vecchia generazione, hanno sonde di tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome) le quali si ottengono per clonaggio di frammenti di genoma umano ed hanno dimensioni medie di circa 160.000 paia di basi.
Gli oligo-arrays hanno invece sonde solitamente ottenute per sintesi e con dimensioni variabili da 20 a 100 basi. Gli oligo-arrays, grazie alle dimensioni ridotte e alla maggior specificità delle sonde oligo, rappresentano un notevole progresso tecnologico nell’analisi array-CGH.
Numerose pubblicazioni scientifiche hanno evidenziato i significativi vantaggi che si ottengono utilizzando gli oligo-arrays, i quali consistono essenzialmente in una risoluzione molto più elevata, maggior accuratezza nella definizione delle anomalie genomiche e dei punti di rottura, maggior specificità e una notevole riduzione dei risultati falsi positivi e falsi negativi.
Quali patologie sono investigate da Array-CGH?
Mediante la suddetta procedura, inoltre, si può oggi effettuare non solo lo studio dell’assetto cromosomico fetale in tempi rapidissimi (2-3 giorni), ma si possono anche identificare patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni e le micro duplicazioni), non evidenziabili tramite il cariotipo tradizionale. In tal modo può essere contemporaneamente studiato un ampio gruppo di 100 sindromi cromosomiche o genetiche, incluse quelle che implicano il riarrangiamento dei subtelomeri (componenti microscopiche del DNA), che sono stati recentemente riconosciuti tra le cause di ritardo mentale.
Di seguito viene riportato l’elenco delle 100 patologie causate da microdelezione/microduplicazione cromosomica e degli oltre 150 geni che vengono investigate con il cariotipo molecolare mediante tecnica Array-CGH:
| Disease | OMIM | Locus | Cyto band |
| 1p36 Deletion Syndrome | 607872 | P21127-10 | 1p36.33 |
| 1q21.1 Deletion Syndrome, 1.35-Mb | 612474 | N/A | 1q21.1 |
| 3q29 Microdeletion Syndrome | 609425 | DLG1, PAK2 | 3q29 |
| 15q13.3 Microdeletion Syndrome | 612001 | N/A | 15q13.2-q13.3 |
| 17q21.31 Microdeletion Syndrome | 610443 | CRHR1, MAPT | 17q21.31 |
| 22q11.2 Deletion Syndrome, Distal | 611867 | N/A | 22q11.21-q11.23 |
| 22q13.3 Deletion Syndrome | 606232 | SHANK3 | 22q13.33 |
| Adenomatous Polyposis Of The Colon; Apc | 175100 | APC | 5q22.2 |
| Adrenal Hypoplasia, Congenital; Ahc | 300200 | NR0B1 | Xp21.2 |
| Alagille Syndrome 1; Algs1 | 118450 | JAG1 | 20p12.2 |
| Angelman Syndrome; As | 105830 | UBE3A ATP10A MECP2 | 15q11.2 15q12 Xq28 |
| Aniridia; An | 106210 | PAX6 | 11p13 |
| Autism | 209850 | N/A RPL10 | 16p11.2 Xq28 |
| Autism, X-Linked, Susceptibility To, 2 | 300495 | NLGN4X | Xp22.31-p22.32 |
| Autism, X-Linked, Susceptibility To, 1 | 300425 | NLGN3 | Xq13.1 |
| Autism, X-Linked, Susceptibility To, 3 | 300496 | MECP2 | Xq28 |
| Basal Cell Nevus Syndrome; Bcns | 109400 | PTCH1 | 9q22.32 |
| Beckwith-Wiedemann Syndrome; Bws | 130650 | NSD1 H19, IGF2 KCNQ1 CDKN1C | 5q35.2-q35.3 11p15.5 11p15.4-p15.5 11p15.4 |
| Brachydactyly-Mental Retardation Syndrome; Bdmr | 600430 | Z51342 | 2q37.3 |
| Branchiootorenal Syndrome 1; Bor1 | 113650 | EYA1 | 8q13.3 |
| Bruton Agammaglobulinemia Tyrosine Kinase; Btk | 300300 | BTK | Xq22.1 |
| Buschke-Ollendorff Syndrome | 166700 | N/A | 12q14.2-q15 |
| Campomelic Dysplasia | 114290 | SOX9 | 17q24.3 |
| Cat Eye Syndrome; Ces | 115470 | CECR5, CECR1, CECR6 | 22q11.1 |
| Charcot-Marie-Tooth Disease, Demyelinating, Type 1a; Cmt1a | 118220 | PMP22 | 17p12 |
| Charcot-Marie-Tooth Disease, X-Linked, 1; Cmtx1 | 302800 | GJB1 | Xq13.1 |
| Charge Syndrome | 214800 | CHD7 | 8q12.2 |
| Cleidocranial Dysplasia; Ccd | 119600 | RUNX2 | 6p12.3 |
| Cornelia De Lange Syndrome 1; Cdls1 | 122470 | NIPBL | 5p13.2 |
| Cri-Du-Chat Syndrome | 123450 | TERT Z23908 | 5p15.33 5p15.2 |
| Dandy-Walker Syndrome; Dws | 220200 | ZIC1, ZIC4 | 3q24 |
| Diaphragmatic Hernia, Congenital | 142340 | CHD2 NR2F2 | 15q26.1 15q26.2 |
| Digeorge Syndrome, Velocardiofacial Syndrome Spectrum Of Malformation 2 | 601362 | D10S293 NEBL | 10p14 10p12.31 |
| Digeorge Syndrome; Dgs | 188400 | HIRA, TBX1 | 22q11.21 |
| Dosage-Sensitive Sex Reversal; Dss | 300018 | NR0B1 | Xp21.2 |
| Down Syndrome | 190685 | DSCR2 GATA1 | 21q22.2 Xp11.23 |
| Feingold Syndrome | 164280 | MYCN | 2p24.3 |
| Fragile X Mental Retardation Syndrome | 300624 | FMR1 | Xq27.3 |
| Greig Cephalopolysyndactyly Syndrome; Gcps | 175700 | GLI3 | 7p14.1 |
| Heterotaxy, Visceral, 1, X-Linked; Htx1 | 306955 | ZIC3 | Xq26.3 |
| Holoprosencephaly | 236100 | TMEM1 | 21q22.3 |
| Holoprosencephaly 2; Hpe2 | 157170 | SIX3 | 2p21 |
| Holoprosencephaly 3; Hpe3 | 142945 | SHH | 7q36.3 |
| Holoprosencephaly 4; Hpe4 | 142946 | TGIF1 | 18p11.31 |
| Holoprosencephaly 5; Hpe5 | 609637 | ZIC2 | 13q32.3 |
| Hyperglycerolemia | 307030 | GK3P | Xp21.2 |
| Hypoparathyroidism, Sensorineural Deafness, And Renal Disease | 146255 | GATA3 | 10p14 |
| Ichthyosis, X-Linked; Xli | 308100 | STS | Xp22.31 |
| Jacobsen Syndrome; Jbs | 147791 | N/A | 11q23.1-q24.1 |
| Johanson-Blizzard Syndrome; Jbs | 243800 | UBR1 | 15q15.2 |
| Joubert Syndrome 4; Jbts4 | 609583 | NPHP1 | 2q13 |
| Kabuki Syndrome | 147920 | N/A | 8p22 |
| Kallmann Syndrome 1; Kal1 | 308700 | KAL1 | Xp22.31 |
| Leri-Weill Dyschondrosteosis; Lwd | 127300 | SHOX¹ | Xp22.33 |
| Lissencephaly, X-Linked, 1; Lisx1 | 300067 | DCX | Xq22.3-q23 |
| Mental Retardation, X-Linked, With Panhypopituitarism | 300123 | SOX3 | Xq27.1 |
| Metachromatic Leukodystrophy | 250100 | ARSA | 22q13.33 |
| Microphthalmia, Syndromic 7; Mcops7 | 309801 | HCCS, ARHGAP6 | Xp22.2 |
| Miller-Dieker Lissencephaly Syndrome; Mdls | 247200 | PAFAH1B1, YWHAE, HIC1 | 17p13.3 |
| Mitochondrial Complex I Deficiency | 252010 | NDUFS2 NDUFS1 NDUFS6 NDUFS4 NDUFA12L PTPMT1 NDUFS8, NDUFV1 NDUFV2 NDUFS7 | 1q23.3 2q33.3 5p15.33 5q11.2 5q12.1 11p11.2 11q13.2 18p11.22 19p13.3 |
| Muscular Dystrophy, Becker Type; Bmd | 300376 | DMD DXS7 | Xp21.1-p21.2 Xp11.3 |
| Muscular Dystrophy, Duchenne Type; Dmd | 310200 | DMD | Xp21.1-p21.2 |
| Nail-Patella Syndrome; Nps | 161200 | LMX1B | 9q33.3 |
| Nephronophthisis 1; Nphp1 | 256100 | NPHP1 | 2q13 |
| Neurofibromatosis, Type I; Nf1 | 162200 | NF1 | 17q11.2 |
| Neurofibromatosis, Type Ii; Nf2 | 101000 | NF2 | 22q12.2 |
| Neuropathy, Hereditary, With Liability To Pressure Palsies; Hnpp | 162500 | PMP22 | 17p12 |
| Noonan Syndrome 1; Ns1 | 163950 | PTPN11 | 12q24.13 |
| Pelizaeus-Merzbacher Disease; Pmd | 312080 | PLP1 | Xq22.2 |
| Polycystic Kidney Disease, Infantile Severe, With Tuberous Sclerosis; Pkdts | 600273 | PKD1 | 16p13.3 |
| Potocki-Lupski Syndrome; Ptls | 610883 | RAI1, MFAP4, FLII | 17p11.2 |
| Potocki-Shaffer Syndrome | 601224 | ALX4, EXT2 | 11p11.2 |
| Prader-Willi Syndrome; Pws | 176270 | SIM1 | 6q16.3 |
| Prader-Willi Syndrome; Pws | 176270 | SNRPN, NDN | 15q11.2 |
| Retinoblastoma; Rb1 | 180200 | RB1 | 13q14.2 |
| Rett Syndrome; Rtt | 312750 | CDKL5 MECP2 | Xp22.13 Xq28 |
| Rieger Syndrome, Type 1; Rieg1 | 180500 | PITX2 | 4q25 |
| Rubinstein-Taybi Syndrome; Rsts | 180849 | CREBBP | 16p13.3 |
| Saethre-Chotzen Syndrome; Scs | 101400 | TWIST1 | 7p21.1 |
| Sex-Determining Region Y; Sry | 480000 | SRY | Yp11.31 |
| Smith-Magenis Syndrome; Sms | 182290 | RAI1, MFAP4, FLII | 17p11.2 |
| Sotos Syndrome | 117550 | NSD1 | 5q35.2-q35.3 |
| Spermatogenic Failure, Nonobstructive, Y-Linked | 415000 | USP9Y, UTY CDY2B JARID1D NR_001537, DAZ3, DAZ1, DAZ2 | Yq11.21 Yq11.221 Yq11.222 Yq11.223 |
| Split-Hand/Foot Malformation 1; Shfm1 | 183600 | SHFM1 | 7q21.3 |
| Split-Hand/Foot Malformation 3; Shfm3 | 600095 | FBXW4 | 10q24.32 |
| Split-Hand/Foot Malformation 4; Shfm4 | 605289 | TP63 | 3q28 |
| Split-Hand/Foot Malformation 5; Shfm5 | 606708 | DLX1, EVX2 | 2q31.1 |
| Synpolydactyly 1; Spd1 | 186000 | HOXD13 | 2q31.1 |
| Townes-Brocks Syndrome; Tbs | 107480 | SALL1 | 16q12.1 |
| Trichorhinophalangeal Syndrome, Type I; Trps1 | 190350 | TRPS1 | 8q23.3 |
| Trichorhinophalangeal Syndrome, Type Ii; Trps2 | 150230 | TRPS1 EXT1 | 8q23.3 8q24.11 |
| Tuberous Sclerosis; Ts | 191100 | TSC1 TSC2 | 9q34.13 16p13.3 |
| Velocardiofacial Syndrome | 192430 | ARVCF, TBX1 | 22q11.21 |
| Williams-Beuren Region Duplication Syndrome | 609757 | N/A | 7q11.23 |
| Williams-Beuren Syndrome; Wbs | 194050 | GTF2IRD1, MLXIPL, BAZ1B, ELN, RFC2, WBSCR22, FKBP6, GTF2I, LAT2, BCL7B, TBL2, CLIP2, EIF4H, LIMK1, WBSCR27, WBSCR16, FZD9, WBSCR23 | 7q11.23 |
| Wilms Tumor 1; Wt1 | 194070 | WT1 | 11p13 |
| Wilms Tumor, Aniridia, Genitourinary Anomalies, And Mental Retardation | 194072 | PAX6 | 11p13 |
| Wolf-Hirschhorn Syndrome; Whs | 194190 | WHSC1 MSX1 | 4p16.34p16.2 |
L’esperienza di Genoma su Array-CGH
I professionisti che operano nel laboratorio GENOMA sono impegnati da anni nello studio di patologie genetiche o cromosomiche utilizzando l’analisi genomica basata su microarray (Array-CGH). Grazie al know-how e l’esperienza di migliaia di analisi maturati, gli operatori di GENOMA sono annoverati in Italia e all’estero tra i maggiori esperti nei settori della citogenetica molecolare, della genomica e dell’analisi microarray.
GENOMA offre servizi di indagini genetiche utilizzando le tecnologie più avanzate e avvalendosi dell’esperienza e la professionalità garantita da specialisti esperti nel campo della genetica e dell’analisi microarray.
