Cos’è l’analisi del cariotipo tradizionale?

L’indicazione principale in diagnosi prenatale è rappresentata dallo studio dell’assetto cromosomico fetale mediante l’analisi del cariotipo tradizionale, al fine di evidenziare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche. Tale esame viene effettuato attraverso la coltura e lo studio delle cellule fetali presenti nel liquido amniotico o nei villi coriali. 
L’associazione a tutti nota tra età materna avanzata e rischio di non disgiunzione cromosomica è ben documentata ed i dati epidemiologici riguardano non solo la trisomia 21 o Sindrome di Down, la più frequente anomalia cromosomica riscontrabile alla nascita, ma anche aneuploidie a carico dei cromosomi 18, 13, X, Y o altri cromosomi. 
Le malattie provocate dalle anomalie cromosomiche sono tra le più importanti cause di abortività, di morte fetale o malformazioni congenite; esse derivano da variazioni nel numero o alterazioni nella struttura dei cromosomi.

Un difetto o un eccesso dei cromosomi può provocare sintomi più o meno gravi. La più frequente alterazione dei cromosomi non sessuali è la sindrome di Down, dovuta alla presenza di un cromosoma 21 in più (trisomia 21); questa patologia risulta più frequente con l’aumentare dell’età materna, passando da un rischio di circa 1 caso su 1000 a 28-30 anni ad 1 caso su 400 a 35 anni ed 1 caso su 200 a 38 anni.

Altri difetti riscontrabili con minore frequenza sono la trisomia del cromosoma 18 e del cromosoma 13, tutti associati al ritardo mentale e, talora, a malformazioni e difetti di crescita.

Anche i cromosomi del sesso possono andare incontro a difetti sia numerici che strutturali, ma spesso sono causa di una sintomatologia più lieve.
Le più frequenti alterazioni dei cromosomi sessuali sono la sindrome di Turner, dovuta alla mancanza di un cromosoma X nelle femmine ed interessa 1 caso su 2500 e la sindrome di Klinefelter dovuta alla presenza di un cromosoma X in più nei maschi, con una frequenza di 1 caso su 700.

RISCHIO DELLA NASCITA DI UN BAMBINO CON UN’ANOMALIA CROMOSOMICA:

Età materna	Rischio di sindrome di Down	Rischio di anomalia cromosomica
20	1/1667	1/526
22	1/1429	1/500
24	1/1250	1/476
26	1/1176	1/476
28	1/1053	1/435
30	1/952	1/384
32	1/769	1/323
34	1/500	1/238
35	1/385	1/192
36	1/294	1/156
37	1/227	1/127
38	1/175	1/102
39	1/137	1/83
40	1/106	1/66
41	1/82	1/53
42	1/64	1/42
43	1/50	1/33
44	1/38	1/26
45	1/30	1/21
46	1/23	1/16
47	1/18	1/13
48	1/14	1/10
49	1/11	1/8

Quali sono le anomalie cromosomiche?

In seguito a mutazioni il cariotipo può modificarsi nel numero o nella morfologia dei cromosomi che lo costituiscono, dando così origine rispettivamente alle anomalie numeriche dei cromosomi (aneuploidie) e alle anomalie strutturali dei cromosomi. 

Le aneuploidie numeriche più frequenti osservate nell’uomo sono la monosomia (assenza di un elemento nella coppia di cromosomi omologhi) e la trisomia (presenza di un elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi). In questi casi si parla di monosomia e trisomia completa, ma si possono verificare anche monosomie/trisomie parziali, per assenza o presenza in triplice copia di singoli segmenti di cromosoma.

Le monosomie complete sono incompatibili con la vita postnatale, l’eccezione è rappresentata dalla monosomia del cromosoma X, associata alla sindrome di Turner (45,X).
Le trisomie complete di alcuni cromosomi, come la trisomia 21 o sindrome di Down (47,XX,+21),  trisomia 18 o sindrome di Edwards (47,XX,+18), trisomia 13 o sindrome di Patau (47,XX,+13) sono invece compatibili con la vita postnatale, così come le aneuploidie dei cromosomi sessuali.

L’aneuploidia è causata, nella maggior parte dei casi, da errori di non-disgiunzione alla meiosi che causano la formazione di due cellule (gameti) che contengono rispettivamente un cromosoma in più ed uno in meno. La causa della non-disgiunzione non è nota, ma si verifica con maggior frequenza nella meiosi femminile ed aumenta con l’età. Da ciò deriva un aumentato rischio di patologia cromosomica fetale in madri di età superiore o uguale a 35 anni. La non disgiunzione si può verificare anche durante la divisione mitotica, in tal caso si osserverà un cariotipo a mosaico per la presenza nello stesso individuo di cellule a corredo cromosomico diverso.

Le anomalie cromosomiche di numero più frequentemente riscontrate sono la trisomia 21, la trisomia 18, la trisomia 13, tutte associate al ritardo mentale e, talora, a malformazioni e difetti di crescita. Anche i cromosomi del sesso possono andare incontro a difetti sia numerici (polisomie, 47,XXY;47,XXX; 47,XYY), ma spesso sono causa di una sintomatologia più lieve. Le più frequenti alterazioni dei cromosomi sessuali sono la sindrome di Turner, dovuta alla mancanza di un cromosoma X nelle femmine e la sindrome di Klinefelter dovuta alla presenza di un cromosoma X in più nei maschi.

Patologia	Anomalia cromosomica	Frequenza alla nascita
Sindrome di Down	47,XX(oppure XY),+ 21	1 :700
Sindrome di Edwards	47,XX(oppure XY),+ 18	1: 6.000- 8.000
Sindrome di Patau	47,XX(oppure XY),+ 13	1: 10.000
Sindrome di Turner	45,X	1: 5.000 femmine
Sindrome di Klinefelter	47,XXY	1: 1.000 maschi

Con il cariotipo è inoltre possibile individuare anche  alterazioni di struttura dei cromosomi.
Le anomalie strutturali originano dalla rottura di uno o più cromosomi e, poiché queste rotture possono teoricamente avvenire ovunque nel genoma, il numero di potenziali riarrangiamenti è praticamente infinito. 

I riarrangiamenti strutturali si dividono in due grandi gruppi : bilanciati e sbilanciati. 

Le alterazioni cromosomiche strutturali bilanciate non danno luogo né a perdita né ad guadagno di materiale genetico e le persone portatrici sono generalmente fenotipicamente normali. Possono essere sia ereditate da un genitore (portatore sano) o possono verificarsi “de novo” e quindi essere riscontrate nelle solo nelle cellule fetali.
Le anomalie sbilanciate, invece, provocano perdita/guadano di materiale genetico, perciò vengono identificate in soggetti con fenotipo clinico. I principali tipi di anomalie strutturali sono:

1. Le delezioni, che consistono nella perdita di un segmento di un cromosoma, che può essere terminale o interstiziale. Di solito le sindromi da delezione interessano segmenti relativamente grandi di cromosoma (> 10 Mb = Megabasi). Delezioni di queste dimensioni possono essere identificate con tecniche di citogenetica tradizionale. Delezioni di dimensione inferiore, definite “microdelezioni”possono essere identificate solo con le più moderne tecniche di citogenetica molecolare (FISH) o di biologia molecolare (array-CGH).
2. Le duplicazioni consistono nella presenza di due copie di un segmento di cromosoma, e pertanto costituiscono delle trisomie parziali. 
3. Le inversioni originano da 2 rotture che avvengono sullo stesso cromosoma e dalla successiva rotazione di 180° del segmento compreso tra i punti di rottura. Le inversioni producono un nuovo allineamento dei geni lungo l’asse di un cromosoma e di solito non si associano ad alterazioni cliniche. I portatori di inversione sono però a rischio riproduttivo, in quanto possono produrre gameti sbilanciati.
4. Le traslocazioni reciproche originano dalla rottura di due o, raramente, di più cromosomi e dallo scambio reciproco dei segmenti, senza perdita o acquisizione di materiale cromosomico. In questo caso si tratta di traslocazioni bilanciate, che hanno una frequenza di circa 1:1.000 nella popolazione generale. I portatori di traslocazioni bilanciate sono generalmente clinicamente normali, ma a rischio riproduttivo, perché possono produrre gameti sbilanciati.
5. Le traslocazioni Robertsoniane hanno una frequenza di 1:1.000 nella popolazione ed originano dalla fusione di due cromosomi acrocentrici, che si sono rotti al centromero od in prossimità di questo. I cromosomi che si originano da questo scambio sono uno dotato di uno o due centromeri ed uno acentrico (cioè senza centromero). Quest’ultimo è instabile e viene perso alla prima divisione cellulare. I portatori di traslocazioni Robertsoniane hanno di conseguenza 45 cromosomi e sono clinicamente normali. Sono anch’essi a rischio riproduttivo potendo produrre gameti sbilanciati.
6. I cromosomi ad anello, detti anche ring, sono originati dalla rottura di entrambe le braccia di un cromosoma, perdita delle regioni distali alle rotture e riunione delle due estremità in una struttura ad anello, appunto. I ring possono essere soprannumerari, ed in tal caso il portatore avrà 47 cromosomi e sarà trisomico per le regioni comprese nel ring, oppure possono aver sostituito un cromosoma normale, ed in tal caso il portatore avrà 46 cromosomi ma sarà parzialmente monosomico, per la perdita delle regioni distali alle rotture. Poiché il segmento di cromosomadeleto di solito contiene numerosi geni, le conseguenze cliniche sono generalmente gravi.
7. I Markers o cromosomi marcatori, sono anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l’espressività fenotipica, caratterizzate dalla presenza piccoli porzioni cromosomiche soprannumerarie di cui non si conosce l’origine, e cioè da quali  cromosomi queste porzioni derivino.

Analisi da liquido amniotico

L’analisi del cariotipo è lo studio del corredo cromosomico di un individuo. La determinazione del cariotipo fetale costituisce un’indagine importante in quanto permette di evidenziare eventuali anomalie cromosomiche, sia numeriche (quali trisomie, monosomie e presenza di un marcatore), che strutturali (traslocazioni, delezioni ed inversioni).

Il cariotipo da liquido amniotico viene effettuato mediante  il prelievo di 20 ml di liquido amniotico per via trans-addominale, sotto controllo ecografico, tra la 15° e la 18° settimana di gestazione. Il liquido prelevato viene centrifugato per separare la parte liquida (che verrà utilizzata per il dosaggio dell’alfafetoproteina) dalla frazione corpuscolata, costituita dalle cellule fetali che sono in sospensione nel liquido amniotico. Tali cellule, definite amniociti, sono poste in coltura con un terreno nutritivo in un adatto incubatore, alla temperatura di 37°C, in queste condizioni le cellule possono continuare continuare a vivere al di fuori dell’organismo. Vengono allestite 3 colture distinte in contenitori sterili costituiti da una plastica particolare che lascia aderire gli amniociti e ne consente la moltiplicazione. Ciascuna cellula che aderisce alla fiasca di coltura inizia la divisione cellulare e forma un “clone” di cellule tutte uguali tra loro. Quando i cloni sono ben sviluppati e in numero sufficiente, e ciò avviene in media in 12-15 giorni, le cellule vengono staccate e deposte su un vetrino sterile (metodica di tripsinizzazione) che favorisce ulteriormente la moltiplicazione cellulare.

Dopo 3 giorni la divisione cellulare viene bloccata in tutte le cellule allo stadio di metafase, con 46 cromosomi ben spiralizzati, tutti composti da due cromatidi e allineati sul piano centrale della cellula (“equatore”). A questo punto la cellula viene aperta con una sostanza ipotonica che rigonfia il nucleo e provoca la rottura della membrana nucleare. Ciò causa lo spargimento dei cromosomi nella zona del vetrino dove prima era situato il nucleo, che possono essere colorati con tecniche diverse, osservati al microscopio e fotografati. Dalla foto di un gruppo di cromosomi appartenenti ad una stessa cellula vengono ritagliate le immagini di ciascun cromosoma e in questo modo è possibile disporre l’immagine di ogni cromosoma ordinatamente su un foglio di carta, eseguendo una sorta di collage. 

I cromosomi vengono disposti in ordine decrescente rispetto alle dimensioni, dal più grande al più piccolo, e avvicinando, a coppie, i due cromosomi uguali od omologhi (ogni membro di una coppia di cromosomi omologhi deriva dal proprio padre ed uno dalla propria madre). Al termine, potremo osservare che sono presenti 22 coppie di cromosomi omologhi, numerate da 1 a 22, per un totale di 44 cromosomi (ad es.: due cromosomi 1, due cromosomi 2, due cromosomi 3, e così via fino a 22). I due rimanenti cromosomi, i cromosomi sessuali o “gonosomi”, sono di due tipi, detti “X” e “Y” per la somiglianza della loro forma a queste due lettere dell’alfabeto. Il cromosoma X è piuttosto grande, di dimensioni simili a quelle del cromosoma 6, mentre il cromosoma Y è molto piccolo, solitamente di dimensioni simili ad un cromosoma 21 o 22 e contiene pochi geni. Il corredo cromosomico femminile comprende due cromosomi X (cioè XX), mentre nel cariotipo maschile si osserva un cromosoma X e un cromosoma Y (cioè XY).

In conclusione quindi, il cariotipo degli individui della specie umana si indica dichiarando il numero totale dei cromosomi (46 se normale), e dopo una virgola, il tipo di cromosomi del sesso. 

Per un feto di sesso femminile avremo quindi 46,XX (cioè cariotipo femminile normale).
Per un feto di sesso maschile 46,XY (cariotipo maschile normale).

La differenza genetica tra uomo e donna solo a livello dei cromosomi del sesso fa comprendere, che questi cromosomi contengano informazioni necessarie al differenziamento del sesso. 

È possibile talora che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, in quanto sono presenti numerose cellule di tipo epiteliale di origine materna che impediscono la crescita anche minima. Si parla in questo caso di insuccesso della coltura. Questa evenienza è comunque rara (avviene in 1 caso su 500, nel nostro centro). È importante mettere in evidenza che la mancata crescita non è assolutamente indice di condizione patologica del feto. Nel caso in cui si verifichi tale possibilità, la madre è contattata immediatamente dal nostro laboratorio per effettuare un nuovo prelievo di liquido amniotico al fine di allestire altre colture cellulari o optare per il cariotipo molecolare mediante tecnica array-CGH, senza la necessità di ripetere il prelievo. 

Indicazioni per la determinazione del cariotipo fetale da liquido amniotico:

• età materna ≥ 35 anni
• alterazioni cromosomiche nei genitori
• storia familiare di aneuploidie
• pregressa aneuploidia fetale
• mosaicismo alla villocentesi
• malformazioni fetali rilevate all’esame ecografico (es. l’aumento dello spessore della translucenza nucale del feto)
• il risultato positivo al test di screening biochimico (tri-test, duo-test)

Analisi da villi coriali

L’analisi del cariotipo è lo studio del corredo cromosomico di un individuo. La determinazione del cariotipo fetale costituisce un’indagine importante in quanto permette di evidenziare eventuali anomalie cromosomiche, sia numeriche (quali trisomie, monosomie e presenza di un marcatore), che strutturali (traslocazioni, delezioni ed inversioni).
Il cariotipo da Villi Coriali viene effettuato mediante  il prelievo di 20 mg circa di villi coriali per via transaddominale sotto controllo ecografico, tra la 11° e la 13° settimana di gestazione. Il materiale prelevato viene lavato ed osservato al microscopio invertito per separare il tessuto materno che potrebbe essere presente dal tessuto fetale.
Nel caso dei villi coriali, si possono usare due metodi analisi cromosomica: diretto e coltura. 

Con il metodo diretto si sfruttano le divisioni spontanee delle cellule. Un’aliquota dei villi, precedentemente puliti, verrà quindi esaminata direttamente dopo una breve incubazione a 37°C. Tale procedura permette di ottenere dei risultati preliminari entro 48-72h. 

Con il metodo della coltura, le cellule sono seminate su un apposito vetrino e incubate alla temperatura di 37°C, in modo tale da potersi moltiplicare. Vengono allestite 2 colture distinte in contenitori sterili costituiti da una plastica particolare che lascia aderire le cellule e ne consente la moltiplicazione. In questo caso ogni cellula dividendosi più volte darà origine a una colonia (un “clone” di cellule tutte uguali tra loro), cioè ad un insieme di cellule che hanno tulle lo stesso corredo cromosomico della cellula originaria. 
Quando i cloni sono ben sviluppati e in numero sufficiente, e ciò avviene in media in 9-15 giorni, le cellule vengono staccate e deposte su un vetrino sterile (metodica di tripsinizzazione) che favorisce ulteriormente la moltiplicazione cellulare. In entrambe le aliquote di villi si procede con il blocco della divisione cellulare allo stadio di metafase, con 46 cromosomi ben spiralizzati, tutti composti da due cromatidi e allineati sul piano centrale della cellula (“equatore”). A questo punto le cellule vengono aperte con una sostanza ipotonica che rigonfia il nucleo e provoca la rottura della membrana nucleare. Ciò causa lo spargimento dei cromosomi nella zona del vetrino dove prima era situato il nucleo, che possono essere colorati con tecniche diverse, osservati al microscopio e fotografati. 

Questa osservazione viene eseguita sui preparati ottenuti da entrambe le aliquote dei villi prelevati, con la differenza che nella metodica diretta  si esaminano le cosiddette “metafasi spontanee”,  che si possono ottenere più rapidamente (ed infatti sono sufficienti solo alcuni giorni per poter studiare il cariotipo fetale), ma la cui qualità è inferiore a quella che si ottiene con i preparati derivanti dalla coltura prolungata, che quindi costituiscono una conferma della prima diagnosi ed anche un approfondimento, perché è possibile vedere più dettagli della struttura cromosomica.

Dalla foto di un gruppo di cromosomi appartenenti ad una stessa cellula vengono ritagliate le immagini di ciascun cromosoma e in questo modo è possibile disporre l’immagine di ogni cromosoma ordinatamente su un foglio di carta, eseguendo una sorta di collage. I cromosomi vengono disposti in ordine decrescente rispetto alle dimensioni, dal più grande al più piccolo, e avvicinando, a coppie, i due cromosomi uguali od omologhi (ogni membro di una coppia di cromosomi omologhi deriva dal proprio padre ed uno dalla propria madre). Al termine, potremo osservare che sono presenti 22 coppie di cromosomi omologhi, numerate da 1 a 22, per un totale di 44 cromosomi (ad es.: due cromosomi 1, due cromosomi 2, due cromosomi 3, e così via fino a 22). I due rimanenti cromosomi, i cromosomi sessuali o “gonosomi”, sono di due tipi, detti “X” e “Y” per la somiglianza della loro forma a queste due lettere dell’alfabeto. Il cromosoma X è piuttosto grande, di dimensioni simili a quelle del cromosoma 6, mentre il cromosoma Y è molto piccolo, solitamente di dimensioni simili ad un cromosoma 21 o 22 e contiene pochi geni. Il corredo cromosomico femminile comprende due cromosomi X (cioè XX), mentre nel cariotipo maschile si osserva un cromosoma X e un cromosoma Y (cioè XY).

In conclusione quindi, il cariotipo degli individui della specie umana si indica dichiarando il numero totale dei cromosomi (46 se normale), e dopo una virgola, il tipo di cromosomi del sesso. 

Per un feto di sesso femminile avremo quindi 46,XX (cioè cariotipo femminile normale).
Per un feto di sesso maschile: 46,XY (cariotipo maschile normale).

La differenza genetica tra uomo e donna solo a livello dei cromosomi del sesso fa comprendere, che questi cromosomi contengano informazioni necessarie al differenziamento del sesso. 

È possibile talora che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, in quanto sono presenti numerose cellule di tipo epiteliale di origine materna che impediscono la crescita anche minima. Si parla in questo caso di insuccesso della coltura. Questa evenienza è comunque rara (avviene in 1 caso su 100, nel nostro centro). È importante mettere in evidenza che la mancata crescita non è assolutamente indice di condizione patologica del feto. Nel caso in cui si verifichi tale possibilità, la madre è contattata immediatamente dal nostro laboratorio per effettuare un prelievo di liquido amniotico al fine di allestire altre colture cellulari o optare per il cariotipo molecolare mediante tecnica array-CGH, senza la necessità di ripetere il prelievo. 

Indicazioni per la determinazione del cariotipo fetale da villi coriali: 

• età materna ≥ 35 anni
• alterazioni cromosomiche nei genitori
• storia familiare di aneuploidie
• pregressa aneuploidia fetale
• malformazioni fetali rilevate all’esame ecografico (es. l’aumento dello spessore della translucenza nucale del feto)
• il risultato positivo al test di screening biochimico (tri-test, duo-test)

Quali sono i limiti dell’esame del cariotipo tradizionale?

L’esame del cariotipo, pur mettendo in evidenza le principali anomalie cromosomiche, ha tuttavia dei limiti diagnostici: 

• Limiti di risoluzione: con l’esame standard, che viene eseguito di routine in tutti i laboratori, vengono messe in evidenza con chiarezza sia le aneuploidie, cioè le alterazioni  del numero dei cromosomi, responsabili delle sindromi più frequenti (come ad esempio la trisomia 21 o Sindrome di Down), che le alterazioni strutturali di una certa entità. Cioè sono evidenziabili con l’esame standard solo le anomalie strutturali più grandi di 10-15 Mb con una risoluzione di bandeggio di 350-400 bande.  È quindi comunque di fondamentale importanza il ruolo della consulenza genetica, che dovrebbe sempre accompagnare la diagnosi prenatale ed  essere consigliata almeno in caso di referti che differiscano dal “cariotipo normale”. Consiste in un colloquio con il genetista, che sarà pronto a spiegare con chiarezza   ed in modo approfondito tutti gli aspetti della diagnosi prenatale effettuata, illustrandone i limiti e le possibilità diagnostiche, sempre tenendo presente il rischio genetico della specie umana che è pari al 3%.
• Insuccesso della coltura: è possibile talora che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, in quanto sono presenti numerose cellule di tipo epiteliale di origine materna che impediscono la crescita anche minima. Si parla in questo caso di insuccesso della coltura. Questa evenienza è rara nel caso di liquido amniotico (avviene in 1 caso su 500, nel nostro centro), un po’ più frequente nel caso di villi coriali (1 caso su 100). Nel caso in cui si verifichi una mancata crescita della coltura cellulare, la paziente viene contattata immediatamente dal nostro Centro per effettuare o un nuovo prelievo al fine di allestire altre colture cellulari o optare per il cariotipo molecolare mediante tecnica array-CGH, senza la necessità di ripetere il prelievo.
• La possibilità di  contaminazione con cellule materne, che avviene nello 0.3% dei casi e richiede ulteriori indagini.
• Rischio interpretativo: l’analisi citogenetica delle cellule del liqiodo amniotico riflette nel 99% dei casi il patrimonio cromosomico del feto, ed identifica il corrispondente fenotipo, ma ci sono dei casi in cui traslocazioni o mosaicismi rendono difficile la definizione fenotipica. Risulta piuttosto intuitivo comprendere come tali osservazioni dipendano molto dalla qualità del materiale prelevato e dalla esperienza dei laboratori di citogenetica prenatale.
• Possibilità di artefatti “in vitro”: Questo può avvenire infatti dal 2% al 3% delle colture. Tra le altre si verificano più frequentemente poliploidie. Il cromosoma 20, per esempio, è uno dei cinque cromosomi più frequentemente coinvolti in pseudomosaicismi. L’origine delle cellule è probabilmente extraembrionaria ed il mosaicismo, in tali casi, non è ovviamente presente nei tessuti fetali. Solo circa il 20% di tali alterazioni del cariotipo corrisponde ad un effettivo difetto nel feto.
• Necessità di approfondimenti diagnostici di 2˚ livello: in alcuni casi si riscontrano anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l’espressività fenotipica. Si tratta il più delle volte di piccoli porzioni cromosomiche soprannumerarie (markers), oppure anomalie cromosomiche strutturali come inversioni o traslocazioni, apparentemente bilanciate, che interessano essenzialmente gli autosomi. L’indagine sui genitori è di grande ausilio poichè, spesso, si riscontra la stessa anomalia in uno di essi. Qualora ci si trovasse, invece, di fronte ad una mutazione “de novo” avvenuta nel feto, è necessario un approfondimento diagnostico mediante tecnica array-CGH (cariotipo molecolare),  al fine di stabilire se nella traslocazione o inversione vi sia stata perdita (delezione) o guadagno (duplicazione) di materiale genetico. Per quel che concerne le numerose alterazioni che si associano ai cromosomi sessuali ( es. 45,x ; 47,xxx ; 47,xxy ; ecc) i genitori vanno informati che il più delle volte sono compatibili con un fenotipo perfettamente normale. Spesso è presente sterilità ma il ritardo psico-fisico è scarso ed incostante.

Specifici problemi correlati al cariotipo fetale da villi coriali:

• La possibile discrepanza tra l’assetto cromosomico dei villi coriali e il cariotipo fetale con la possibilità di falsi positivi o falsi negativi. I falsi positivi (l’incidenza riportata in ampie casistiche è 1%) sono segnalati soprattutto quando viene utilizzata la sola tecnica diretta e sono controllabili sulla coltura o eventualmente sul liquido amniotico nel secondo trimestre. I falsi negativi sono rari (0.02%), e anche questi legati alla sola tecnica diretta.
• Il mosaicismo (la presenza cioè di due linee cellulari con differente assetto cromosomico all’interno dello stesso individuo): le cellule dei villi coriali presentano la caratteristica di essere portatrici di mosaicismi veri e propri che poi, al controllo, non sono presenti nei feti. Tale mosaicismo viene riscontrato nell’1% dei campioni prelevati. In caso di mosaicismo la cromosomopatia potrebbe coinvolgere il feto o essere confinata solamente agli annessi extra-embrionari, occorre perciò estendere l’indagine ad altri tessuti fetali (es. liquido amniotico o sangue) per chiarirne il significato clinico. Il mosaicismo è confermato nel feto in 10%-40% dei casi
• Insorgenza di aberrazioni “in vitro”: la maggior parte delle aberrazioni cromosomiche riscontrate nelle villocentesi sono da riferirsi a pseudomosaicismi. Con tale termine si intende la presenza di un cromosoma extranumerario presente solo nei villi ma del tutto assente nel feto. Questi, ovviamente, non hanno significato clinico. Per stabilire che si tratta di tale artefatto, il genetista esperto si basa essenzialmente sulle seguenti due considerazioni. La prima è che la cellula aberrante è solitamente unica quando ci si trova a leggere un allestimento diretto e, in coltura, l’alterazione interessa pertanto un unico clone di crescita. In tal modo nelle cellule coltivate l’aberrazione appartiene sempre a zone isolate di una stessa flasca. La seconda considerazione è che, solitamente, ci si trova di fronte a mosaicismi che non sono compatibili con la vita e che, pertanto, sono da considerare assolutamente come errori di coltura. Ad esempio sono molto frequenti i riscontri occasionali di patrimoni aberranti aneuploidi come il tetraploide. Il problema però può sorgere di fronte ad una anomalia possibile come la trisomia. Benchè il solo parametro di un riscontro in mitosi isolate debba tranquillizzarci, noi siamo comunque soliti, in tali casi, informare la coppia e procedere all’amniocentesi di verifica. 

Cos’è il mosaicismo?

Il mosaicismo cromosomico rappresenta uno dei principali problemi diagnostici nella determinazione del cariotipo fetale sia da villi coriali che da liquido amniotico. Il mosaicismo fetale vero, il mosaicismo confinato alla placenta (CPM) e lo pseudomosaicismo nelle colture di liquido amniotico sono stati classificati in letteratura sulla base di situazioni osservate nella pratica di laboratorio.

Il CPM, lo pseudomosaicismo e il mosaicismo vero possono avere origine da:

• un errore mitotico postzigotico precoce in un embrione diploide normale
• un fenomeno di ricostituzione della disomia da un concepimento trisomico (rescue)

Villi Coriali
Il mosaicismo può presentarsi in tre distinte situazioni:
Tipo I: l’anomalia cromosomica a mosaico risulta presente solo nel citotrofoblasto, cioè osservata nelle metafasi ottenute con il metodo diretto e non in quelle ottenute dopo coltura
Tipo II: il cariotipo anomalo a mosaico si osserva solo nella componente mesenchimale del villo, indagabile con il metodo colturale e non nel citotrofoblasto
Tipo III: la linea cellulare anomala è presente sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima. Il riconoscimento di una condizione di mosaicismo nei villi coriali richiede generalmente una conferma nel secondo trimestre. Nel caso in cui la linea cellulare anomala sia confermata si è in presenza di un mosaicismo vero, nel caso contrario si ha un CPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziato.
Differenze nel cariotipo delle diverse componenti dell’unità feto-placentare (citotrofoblasto, mesenchima e feto) vengono osservate nell’1%-2% circa dei prelievi di villi coriali.

Liquido Amniotico
Nel caso del liquido amniotico si possono evidenziare tre livelli di mosaicismo:
I Livello: presenza di singola cellula con anomalia numerica o strutturale osservabile con una frequenza che varia dal 2.5% al 7% nelle colture di amniociti.
II Livello: due o più cellule con la stessa alterazione provenienti da una coltura in fiasca oppure singola colonia o più colonie anomale osservate in una singola coltura in situ; si è stimata una frequenza pari allo 0.7%–1.1% per tale osservazione.
III Livello: più metafasi o colonie osservate in almeno due preparati provenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture in situ indipendenti I Livello e II livello sono comunemente definiti come pseudomosaicismo mentre il III Livello viene definito mosaicismo fetale vero.
La condizione di mosaicismo fetale vero osservata in prelievi di liquido amniotico è un fenomeno raro, stimato intorno al 2 per 1000, mentre lo pseudomosaicismo risulta più frequente, come ricordato prima.

Problematiche relative all’osservazione di pseudomosaicismo ed eventuale segnalazione dello stesso nel referto
Il riscontro di uno o più cloni (metodo in situ) o di più cellule (metodo in fiasca) in una singolacoltura di liquido amniotico con corredo cromosomico diverso da quello riscontrato nellecolonie/ cellule delle altre colture, corrisponde ad un mosaicismo di secondo livello (Gardnerand Sutherland, 1996) più comunemente definito come pseudomosaicismo. Al fine di chiarire al meglio la condizione fetale devono essere programmate le indagini più opportune. I problemi tecnici o scientifici non devono essere riversati sulla paziente.

Il citogenetista responsabile dell’analisi ha due possibilità :

• non segnalare nel referto l’osservazione del/i singolo/i clone/i (metodo in situ) o cellule (metodo in fiasca) anomalo/i/e 
• segnalare nel referto tale osservazione.

Nel primo caso il citogenetista arriva alla conclusione che l’osservazione tecnica non corrisponde ad un problema fetale importante e pertanto il cariotipo viene definito normale.

Nel secondo caso il citogenetista decide che l’osservazione di pseudomosaicismo sia una spia di un problema fetale effettivo e pertanto lo segnala nel referto, accompagnandolo dalle spiegazioni del caso o inviando la paziente ad un genetista esperto di diagnosi prenatale per una consulenza genetica.

Si offrono alcune considerazioni:

• i mosaicismi “a bassa percentuale” costituiscono uno dei limiti riconosciuti delle indagini citogenetiche prenatali; tali mosaicismi sono di difficile valutazione non solo a livello tecnico sia pre che post natale ma anche a livello di correlazione con il fenotipo; 
• dati della letteratura indicano che è possibile che i singoli cloni siano derivati da cellule della placenta e pertanto essere indice di un probabile CPM;
• l’esistenza ormai comprovata della disomia uniparentale (UPD) apre la necessità di trasferire le informazioni al riguardo in diagnosi prenatale.

Cos’è la disomia uniparentale?

Con il termine disomia uniparentale (UPD) si definisce l’ereditarietà di due cromosomi omologhi da un solo genitore; è causata principalmente da eventi di non-disgiunzione, seguiti da meccanismi di correzione di trisomie o monosomie. La maggioranza dei casi sembra essere associata all’età materna e può venire individuata inizialmente in forma di trisomia a mosaico durante la diagnosi prenatale, sia nel caso di prelievi di villi coriali che nel caso di prelievi di liquido amniotico. Inoltre anomalie strutturali, come le traslocazioni Robertsoniane e cromosomi marcatori soprannumerari, sembrano essere associate ad un rischio aumentato di UPD.

Indicazioni per lo studio di UPD

Condizioni di mosaicismo
In considerazione del fatto che circa l’1% dei prelievi di villi coriali e lo 0.3% circa dei prelievi di liquido amniotico presentano trisomie a mosaico, ci si trova di fronte ad un sostanziale numero di casi per i quali potrebbe essere necessario eseguire questo tipo di test.
Ogni sforzo deve essere compiuto per l’estensione dell’indagine citogenetica a più tessuti fetali nei casi in cui si osservi mosaicismo al fine di escludere l’evenienza di mosaicismo fetale vero.
Al momento attuale si rende necessaria l’esecuzione del test in tutti i casi in cui sia stata evidenziata la presenza di:

• trisomia a mosaico per il cromosoma 15, in quanto è stata chiaramente dimostrata la correlazione tra UPD materna e paterna e l’espressione di fenotipi patologici come la sindrome di Prader-Willi e la sindrome di Angelman.
• trisomia a mosaico per i cromosomi 7,11 e 14 per la provata esistenza di regioni di questi cromosomi sottoposte al fenomeno dell’imprinting correlata alla manifestazione di fenotipi patologici.

Traslocazioni reciproche, Robertsoniane e cromosomi marcatori soprannumerari
Diversi casi di UPD coinvolgenti cromosomi acrocentrici riguardano traslocazioni Robertsoniane, sia de novo che familiari, sia non-omologhe che omologhe. Poiché correzioni del cariotipo sbilanciato sono sempre possibili, soprattutto nei casi a maggior rischio di aneuploidia, come i portatori di riarrangiamenti cromosomici, l’esecuzione del test dovrebbe essere considerata nei casi in cui sia presente una traslocazione coinvolgente i cromosomi 14 e 15, per le ragioni sopra esposte, in presenza di un cariotipo fetale sia bilanciato che normale.
Tale considerazione si deve applicare a maggior ragione nei casi in cui la traslocazione sia osservata de novo e specialmente nel caso di traslocazioni tra omologhi, che di fatto spesso sono isocromosomi.
Sporadici casi di UPD associata alla presenza di traslocazioni reciproche riportati in letteratura rendono tale indicazione puramente speculativa per l’esecuzione del test, almeno nei casi familiari.
In presenza di cromosomi marcatori soprannumerari, specialmente se identificati de novo in diagnosi prenatale, deve essere valutata l’esecuzione del test per la disomia uniparentale, soprattutto nei casi in cui si sospetta o si ha l’evidenza del coinvolgimento dei cromosomi 14 e 15.